Grammvärvimine on kiire meetod ja seda kasutatakse koeproovis bakterite olemasolu nägemiseks ning bakterite klassifitseerimiseks grampositiivseteks või gramnegatiivseteks, lähtudes nende rakuseinte keemilistest ja füüsikalistest omadustest. Grami värvimist kasutatakse peaaegu alati bakteriaalse infektsiooni diagnoosimise esimese sammuna.
See värvimistehnika on saanud nime Taani teadlase Hans Christian Grami (1853 - 1938) järgi, kes töötas selle meetodi välja 1882. aastal ja avaldas selle 1884. aastal meetodina, mille abil eristada kahte tüüpi sarnaste kliiniliste sümptomitega baktereid: Streptococcus pneumoniae (tuntud ka kui Streptococcus pneumoniae). Pneumokokid) ja bakterid Klebsiella pneumoniae.
Samm
Meetod 1 /3: mikroskoobi slaidi ettevalmistamine
Samm 1. Valmistuge laboris töötamiseks
Kandke kindaid ja pikkade juustega lipsu, et vältida testitava proovi bakteriaalset saastumist. Puhastage tööruum tõmbekapi all või mõnes muus hästi ventileeritavas kohas. Enne alustamist kontrollige Bunseni põletit ja veenduge, et mikroskoop töötab korralikult.
Samm 2. Steriliseerige mikroskoobi klaasiklaas
Kui klaasiklaas on määrdunud, peske seda seebi veega, et eemaldada õli ja mustus. Puhastage slaidid etanooli, klaasipuhastusvahendi või mõne muu laboris kasutatava meetodiga.
Samm 3. Asetage proov klaasplaadile
Grami värvimistehnikat saate kasutada meditsiiniproovis bakterite või Petri tassis kasvavate bakterite kultuuri tuvastamiseks. Parimate tulemuste saamiseks kasutage proovi õhukesteks löökideks Gram -värvi. Soovitav on kasutada alla 24 tunni vanuseid proove, kuna vanemad bakterid võivad kahjustada nende rakuseinu ega pruugi reageerida grammvärvimisele.
- Koeproovi kasutamisel lisage klaasist slaidile 1-2 tilka. Laotage slaidile ühtlaselt, et moodustada õhuke kiht pritsimist, libistades seda teise steriilse klaasiklaasi serva abil. Enne järgmise sammu tegemist laske sellel kuivada.
- Kui võtate Petri tassilt baktereid, steriliseerige inokulatsiooniahel Bunseni põletis, kuni see helendab, ja laske sellel jahtuda. Kasutage silmust steriilse vee tilgutamiseks slaidile, seejärel steriliseerige ja jahutage enne kasutamist, et koguda väike bakteriproov. Pärast seda segage õrnalt.
- Puljongis valmistatud bakterid tuleb uuesti keerist kasutades segada, seejärel võtta koos inokulatsiooniahelaga nagu eespool, ilma vett lisamata.
- Kui teil on tampooniproov (tavaliselt tehakse väikese puuvillase otsaga käepidemega), puudutage tampooni ja pöörake seda õrnalt slaidi kohal.
Samm 4. Kergelt kõrge temperatuur võib anda hea määrde
Kuumus hoiab bakterid slaidi peal, nii et need ei lahustu värvimise ajal kergesti. Puudutage slaidi kiiresti kaks kuni kolm korda Bunseni põleti kohal või soojendage slaidi elektrilise liugsoojendi kohal. Ärge kuumutage üle, proov võib kahjustuda. Kui kasutate Bunseni põletit, peaks see olema väikese, kuid sinise leegi asemel suure oranži leegi asemel.
Teise võimalusena võib määrida ka metanooliga, lisades kuivale määrimisele 1-2 tilka metanooli, kuivatades ülejäänud metanooli slaidil, jättes selle vabasse õhku. See tehnika minimeerib rakkude kahjustusi ja tagab puhta slaidipildi tausta
Samm 5. Asetage slaid värvimisaluse kohale
Värvimisalused on valmistatud metallist, klaasist või madalatest plastplaatidest, mille ülaosa katab pehme võrk. Asetage slaidid nende võrkude peale, et teie kasutatav vedelik saaks salve tühjendada.
Kui teil pole värvimisalust, võite jääkuubikute printimiseks asetada slaidi plastalusele
Meetod 2/3: grammiplekiprotsess
Samm 1. Valage määrdele kristallviolett vedelik
Pihustage pipetiga bakteriproovi mõne tilga kristallvioletse värvainega, mida tuntakse ka kui gentianvioletti. Jätke see 30-60 sekundiks. Kristallviolett (KV) eraldub vesilahuses KV+ ja kloriid (Cl-) ioonideks. Need ioonid tungivad nii grampositiivsete kui ka gramnegatiivsete bakterite rakuseintesse ja rakumembraanidesse. KV+ ioon interakteerub bakterirakkude negatiivselt laetud komponentidega, andes rakkudele lilla värvi.
Paljud laborid kasutavad sademete vältimiseks kristallvioletti "Hucker", mis sisaldab ammooniumoksalaati
Samm 2. Loputage kristallvioletti õrnalt
Kallutage slaidi ja kasutage pesupudelit, et piserdada slaidile väike destilleeritud või kraanivee voog. Vesi peaks voolamise pinnalt alla voolama ja seda ei tohi pihustada otse määrimisele. Ärge loputage liigselt. See võib eemaldada grampositiivsete bakterite värvimise.
Samm 3. Loputage määrimine joodiga, seejärel loputage
Loputage määrimist joodiga tilguti abil. Jätke see vähemalt 60 sekundiks sisse, seejärel loputage hoolikalt samamoodi nagu eespool. Negatiivselt laetud iooni kujul olev jood interakteerub KV+ -ga, moodustades kristallvioleti ja joodi vahel suure ühendikompleksi (CV-I ühendi kompleks) raku sise- ja väliskihtides. See ühendite kompleks säilitab kristallvioletse violetse värvi raku sees, värvitud kohtades.
Jood on söövitav aine. Vältida sissehingamist, allaneelamist või nahale sattumist
Samm 4. Lisage värvivalgendit, seejärel loputage kiiresti
Selle olulise etapi jaoks kasutatakse tavaliselt atsetooni ja etanooli 1: 1 segu, mis tuleb hoolikalt ajastada. Asetage slaid teatud nurga alla, seejärel lisage värvivalgendit, kuni loputamiseks kasutatud vees pole enam lillat värvi. See võtab tavaliselt vähem kui 10 sekundit või isegi vähem aega, kui valgendi sisaldab suurt kontsentratsiooni atsetooni. Lõpetage see samm kohe, vastasel juhul leostub värv grampositiivsetest ja negatiivsetest rakkudest ka kristallvioletset värvi ning värvimisprotsessi tuleb korrata. Loputage üleliigne värvivalgendaja kohe, kasutades eelmist tehnikat.
- Asendajana võib kasutada puhast atsetooni (95%+). Mida rohkem atsetooni kasutate, seda kiiremini pleegitus töötab, nii et peate ajastusele rohkem tähelepanu pöörama.
- Kui teil on probleeme selle sammu aja jälgimisega, lisage tilkhaaval värvivalgendit.
Samm 5. Puista vastandvärv määrimisele, seejärel loputa
Vastupidavat plekki, tavaliselt safraniini või fuksiini, kasutatakse kontrasti suurendamiseks gramnegatiivsete ja grampositiivsete bakterite vahel, värvides roosaks või punaseks värvimata (värvitu) bakterid, st gramnegatiivsed bakterid. Jätke vähemalt 45 sekundiks, seejärel loputa.
Fuchsin värvib intensiivselt paljusid gramnegatiivseid baktereid, nagu Haemophilus spp ja Legionella spp. See meetod sobib hästi algajatele
Samm 6. Kuivatage slaid
Saate neid kuivatada vabas õhus või kuivatada, kasutades selleks müüdavat piiblipaberit. Grami värvimisprotsess on lõppenud.
Meetod 3 /3: värvimistulemuste kontrollimine
1. samm. Valmistage ette valgusmikroskoop
Asetage slaid mikroskoobi alla. Bakterite suurus on väga erinev, seega on kogu vajalik suurendus vahemikus 400x kuni 1000x. Teravama pildi saamiseks on soovitatav kasutada objektiivi koos keelekümblusõliga. Kallake keelekümblusõli slaidile, vältides liigutamist tilgutamise ajal, et vältida mullide teket. Liigutage mikroskoobi läätse käepidet nii, et objektiiv lääks oma kohale klõpsab ja õli puudutab.
Õlikümblust saab kasutada ainult spetsiaalselt loodud läätsedel, mitte "kuivadel"
Samm 2. Proovige tuvastada grampositiivseid ja gramnegatiivseid baktereid
Uurige slaidi valgusmikroskoobi all. Gram-positiivsed bakterid on lillad, kuna kristallviolett on paksu rakuseina sisse kinni jäänud. Gramnegatiivsed bakterid on roosad või punased, sest kristallviolett loputatakse läbi õhukeste rakuseinte, kuhu siseneb roosa vastandvärv.
- Kui proov on liiga paks, võib tulemus olla valepositiivne. Värvige uus proov, kui see näitab kõiki grampositiivseid baktereid, et veenduda tulemuse õigsuses.
- Kui kasutate liiga palju värvivalgendit, võib tulemus olla valenegatiivne. Värvige uus proov, kui see näitab kõiki gramnegatiivseid baktereid, et veenduda tulemuse õigsuses.
Samm 3. Võrrelge kuvatavaid tulemusi võrdluspildiga
Kui te ei tea, millised bakterid välja näevad, uurige võrdluspiltide kogumit, mis on tavaliselt sorteeritud kuju ja grammivärvi järgi. Samuti saate vaadata veebiandmebaase [riiklikul mikroobide patogeenide andmebaasil, bakterite fotodel ja paljudel teistel veebisaitidel. Identifitseerimise hõlbustamiseks on allpool toodud näiteid bakteritest, mida tavaliselt esineb või on diagnoosimisel oluline ja mis on klassifitseeritud nende grammi oleku ja kuju järgi.
Samm 4. Tuvastage grampositiivsed bakterid nende kuju alusel
Lisaks klassifitseeritakse bakterid nende kuju järgi mikroskoobi all, kõige sagedamini kookideks (sfäärilised) või varrasteks (silindrilised). Siin on mõned näited grampositiivsetest bakteritest (lillad) nende kuju järgi:
- Grampositiivsed kookid tavaliselt stafülokokid (see tähendab rühmakokid) või streptokokid (see tähendab ahelkookid).
- "Grampositiivsed pulgad nagu Bacillus, Clostridium, Corynebacterium ja Listeria. Vardabakterid Actinomyces spp. tavaliselt on oksad või niidid.
Samm 5. Tuvastage gramnegatiivsed bakterid
Gramnegatiivsed bakterid (roosa värvi) liigitatakse sageli kolme rühma. Cocci on sfäärilise kujuga, vardad on pikad ja õhukesed, samas kui coccoid vardad on nende vahel.
- Gramnegatiivsed kookid Kõige tavalisem on Neisseria spp.
- Gram-negatiivsed vardad nt E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas ja paljud teised. Vibrio cholerae võib vaadelda tavalise varre või painutatud varrena.
- Gramnegatiivsed "kokkoidsed" (või "kokobatsillid") vardabakterid nt Bordetella, Brucella, Haemophilus ja Pasteurella
Samm 6. Kontrollige hoolikalt, kas tulemused on segased
Mõningaid baktereid on nende rakuseinte rabeduse või vahajasuse tõttu raske täpselt värvida. Need bakterid võivad samas rakus või sama määrdumise erinevate rakkude vahel näidata lilla või roosa segu. Bakteriproovid, mis on vanemad kui 24 tundi, võivad seda probleemi näidata, kuid on ka mõningaid bakteriliike, mille värvimine igas proovivõtmise vanuses on raske. Nende bakterite tuvastamiseks on vaja spetsiifilisemaid katseid, näiteks happekindel värvimine, bakterikultuuri jälgimine, KTK kultuurikeskkond või geneetiline testimine.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium ja Propionibacterium spp. kõik on grampositiivsed bakterid, kuid sageli ei ole need selgelt värvunud.
- Väikesed peenikesed bakterid nagu Treponema, Chlamydia ja Rickettsia spp. raske värvida Grami meetodil.
Samm 7. Kõrvaldage järelejäänud tarvikud ja seadmed
See jäätmete kõrvaldamise kord on laborites erinev ja sõltub kasutatud materjalidest. Tavaliselt visatakse värvimisaluses olev vedelik ohtlike jäätmetena märgistatud pudelitesse. Leotage slaidid 10% pleegituslahuses ja visake seejärel teravate esemete anumasse.
Näpunäiteid
- Pidage meeles, et grammi värvimise tulemused on head ainult siis, kui proov on hea. Oluline on patsiente teavitada, et nad saaksid anda hea proovi (nt erinevus röga ja sügava köha vahel rögaproovi saamiseks).
- Värvivalgendajana reageerib etanool aeglasemalt kui atsetoon.
- Ohutuse tagamiseks järgige standardseid laboratoorseid eeskirju.
- Kasutage harjutamiseks põsetampooni, sest see sisaldab nii grampositiivseid kui ka gramnegatiivseid baktereid. Kui näete ainult ühte tüüpi baktereid, võite kasutada liiga vähe või liiga palju valgendit.
- Slaidi kinnitamiseks võite kasutada puidust klambreid.
Hoiatus
- Atsetoon ja etanool on tuleohtlikud ained. Atsetoon eemaldab õli kätelt, muutes naha kergemaks teiste kemikaalide imendumiseks. Kandke kindaid ja kasutage neid ettevaatlikult.
- Ärge laske määrdel kuivada enne, kui olete Grami plekki või vastuvärvi maha loputanud.
Mida sa vajad
- Võrgu näidis
- Klaasist liumägi
- Pipett
- Väike tuleallikas või liugsoojendi või metanool
- Vesi
- Kristallviolett
- Jood
- Värvivalgendaja, näiteks alkohol või atsetoon
- Safraniin
